Development and standardization of methods for monitoring Bcr-Abl transcript levels in clinical practice in Chronic Myeloid Leukemia (CML) and in Philadelphia-positive Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL).

Background

The Philadelphia chromosome is the first cytogenetic marker associated with a neoplastic malignancy and it is present in 95% of chronic myeloid leukemia (CML) and in the 5% and 15-20% of pediatric and adult acute lymphoblastic leukemia (ALL), respectively.

Tyrosine kinase inibitors (TKIs) are a new class of compounds which have been rationally designed and developed to target TK. (1-5)

The introduction of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) as a targeted therapy in the treatment of CML patients has revolutionized the outcome of patients with the achievement in the majority of cases of complete hematologic and cytogenetic responses. Even after these thresholds are achieved, the disease burden continues to progressively decrease with continued treatment. Therefore, more sensitive molecular methods are required to detect and quantify levels of minimal residual disease, especially at long time points after TKI start.

The first clinically available TKI, imatinib, was introduced in 1998 and exerts its effect by competitively binding to the ATP binding pocket of the ABL1 Tyrosine Kinase domain (TDK) and thus preventing access to ATP imatinib as front-line therapy produced complete cytogenetic response in 83% of patients with Ph+ CML correlated with prolonged survival. According to ELN definitions, the overall response to imatinib can be defined as optimal, suboptimal and failure.The second generation TKIs, nilotinb and imatinib, are more potent BCR-ABL TKIs with demonstrated efficacy in patient resistant to or intolerant of imatinib, are active against most BCR-ABL mutations with the exception of T315I, and have well-established safety profiles. They induce faster and higher rates of complete cytogenetic and molecular response. Therefore, both drugs were garanted approval by the US Food and Drug Administration to be used in patients with newly diagnosed CML in chronic phase (CML-CP).

Since using TKI alone can lead to the emergence of resistance, the use of more than on TKI in combination or in rotation can allow to make a substantial improvement over current treatment. Moreover, the achievement of undetectable BCR-ABL transcript levels has been shown to be a key prerequisite for investigating discontinuation of TKI. For this reason a lot of sperimental protocols have been set up in order to evaluate the effects of the drugs and the correlation with molecular response.

In the past, remission was conventionally measured by the normalization of total white cell count (hematologic response) and the achievement of complete cytogenetic response (no identificable Ph- positive marrow metaphases in at least 20 bone marrow cells). (2) Nevertheless, it has been estimated that as many 10^7 leukaemic cells may still be present in the body of a patient in complete cytogenetic remission and lead the interest in more sensitive PCR-based techniques. The molecular monitoring is becoming more and more important to choice the therapeutic strategy.

A key marker of molecular response is the so-called major molecular response (MMR), originally classified as a reduction in BCR-ABL transcripts by at least 3 logs below a standardized baseline value representing the median value of BCR-ABL/BCR present at diagnosis (IRIS trial).(3,4) Achievement of MMR is associated with improved probability of long-term response and improved progression free survival. (6,7)

For clinical assessment of minimal residual disease, many efforts have been made to harmonize worldwide BCR-ABL quantification. During an international consensus meeting in 2005, it was proposed that BCR-ABL measurements should be expressed on an international scale (IS) that is anchored to two standard values: a standardized baseline value taken to be 100% on the IS, and a standardized MMR value taken to 0,1% on the IS. A level of 1-2% IS corresponds roughly to the limit at witch Ph positive metaphases can be detected by standard cytogenetics, that is, lower levels of disease are consistent with CCyR. The complete molecular response CMR was defined as undetectable bcr-abl transcripts with a sensitivity < 10^4.

Thanks to this IS, centres continue to use their estabilished system of BCR-ABL measurement. By the use of laboratory specific conversion factors of reference standards, local results can be converted to the IS and should result in data is more readily comparable between centres.

Recent data, however, has highlighted the shortcomings of this definition. It is not possible to have a single workable definition of CMR, but rather the level response needs to be defined by an upper boundary.

The current definitions, modified after 2011, are:

MR4 = either detectable disease ≤0.01% BCR-ABL1IS or undetectable disease in cDNA with ≥10,000 ABL1 or ≥24,000 GUSB transcripts;

MR4.5 = either detectable disease ≤0.0032% BCR-ABL1IS or undetectable disease with in cDNA with ≥32,000 ABL1 or ≥77,000 GUSB transcripts;

MR5 = either detectable disease ≤0.001% BCR-ABL1IS or undetectable disease with in cDNA with ≥100,000 ABL1 or ≥240,000 GUSB transcripts.

The developments highlight the need for robust, standardized and workable definitions of deep MR. Specifically, it is critical that the measurement of MR is standardized in a manner to withstand both intra- and inter-laboratory variability as well as new methodological developments. Recent performance evaluation studies have indicated that testing laboratories should be able to achieve sufficient sensitivity to enable detection of MR 4.5. In order this, our laboratory will participate to the first Round of standardization EUTOS MR 4.5.

Labnet, thanks to initiative of CML working party of GIMEMA, regroups the Italian centres that work in molecular Biology of CML. The aim is to improve the comparability of results among different laboratories and to optimize the communication with a national network. Now there are a lot of centres in Italy and Bologna is one of the three coordinator centres. For this reason it is organized the V Round of standardization for the inter-laboratory quality in order to control the precision, accurance and sensibility of the technique and confirm or recalculate the conversion factor for each laboratory.

EuroMRD is committed in the standardisation of MRD detection in Philadelphia-positive ALL. Rounds of standardization are setted in order to compare the two control genes ABL and GUSin order to define the lowest ABL/GUS amount for calculation of ratio and to quantify the transcript e1a2. The aim is to obtain guidelines for the qPCR analysis .

Aim

Molecular testing for the BCR-ABL fusion gene by RT-qPCR is the most sensitive routine approach for monitoring the response to therapy of CML and ALL Ph positive patients to choice the therapeutic strategy. Rounds of to standardize the laboratory procedures for bcr-abl monitoring in order to have a reliable, robust, reproducible and sensitive method.

Activity Plan

  • Sample collection and process (2,8,9)

Total white blood cells from peripheral blood (CML) or bone marrow (Ph+ ALL) will be collected in EDTA. For ALL, mononuclear cells will be separated with a density gradient separation (Ficoll) while peripheral blood from CML patients will be processed with Buffy Coat that removes red cells using lysis buffer and permits to isolate a pellet including granulocytes. The entire white cell pellet collected should be lysed in guanidinium thiocynate (GTC). The RNA extraction will be done by the automatic extractor Maxwell or Quiacube and then quantified by Nanodrop.

  • Reverse transcription (10)

The reverse transcription permits the synthesis of complementary DNA (cDNA) from RNA starting template (1µg RNA[i1]). (QUIAGEN)

  • The quantification of the ibrid[i2] transcript is obtained by Real Time PCR that uses a probe, oligonucleotide labelled with fluorescence substance FAM at 5’-end and with quencher (TAMRA) at 3’-end is edded in a reaction system. Under the annealing condition, if the target of interest is present, Taqman probe specifically hybridizes to template DNA between the forward and reverse primer sites, but the fluorescence is suppressed by quencher.(2,8,9,10) In extension step, the 5’-3’ exonuclease activity of Taq DNA Polymerase degrades Taqman probe hybridized to a template. Accordingly, Taqman probe is released from the suppression with a quencher, resulting in emission of fluorescence. The probe fragments are then displaced from target, and polymerization of the strand continues. By measuring the fluorescence intensity during the exponential phase the amount of amplified product can be monitored and the increase of fluorescence is directly proportional to the target amplification during PCR. The number of PCR cycles necessary to detect a signal above the threshold is called the threshold cycle (Ct) and is directly proportional to the amount of target present at the beginning of the reaction. Using different diluitions of standards (plasmids) with a know number of molecules, a standard curve can be estabilished and the precise amount of target present in the test sample determined. The ratio between the normalized copy number of bcr-abl to the normalized copy number abl and molptiply to 100 and to conversion factor express the level of malignancy.
  • Strandardizations

-The Round 1 of EUTOS MR 4.5 performance evaluation will involve analysis of three samples in duplicate with each set of three being analysed in different times. One sample is a lysate in GTC, the second one is an e14a2 armoured RNA (aRNA) sample diluited in a background of ABL1 aRNA, the third is cDNA sample.

-In V Round of standardization of Labnet we will test four calibrators of e14a2 trascript (Asuragen) that are robust, riconuclease-resistant RNA controls and standards produced by assembling specific RNA sequences and recombinant proteins into pseudo-viral particles that are stable at various temperatures and in human matrices.

-In the 11 quality control round for m-bcr (Euro MRD) we will test different diluitions of cDNA from in-house ALL Ph positive patients with different level of malignancy. In order to improve this technique we will test different kits comparing the results with in-house kit in order to obtain results more reliable.

Expected results

We will expect to obtain a standardized system with a conversion factor that will allow us to compare our results to other laboratories and to identify with high sensitivity low levels of bcr-abl transcript.

Bibliography

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  2. Foroni L, Wilson G, Gerrard G, Mason J, Grimwade D, White HE, de Castro DG, Austin S, Awan A, Burt E, Clench T, Farruggia J, Hancock J, Irvine AE, Kizilors A, Langabeer S, Milner BJ, Nickless G, Schuh A, Sproul A, Wang L, Wickham C, Cross NC.Guidelines for the measurement of BCR-ABL1 transcripts in chronic myeloid leukaemia.Br J Haematol.2011 Apr;153(2):179-90
  1. Baccarani M, Cortes J, Pane F, Niederwieser D, Saglio G, Apperley J, Cervantes F, Deininger M, Gratwohl A, Guilhot F, Hochhaus A, Horowitz M, Hughes T, Kantarjian H, Larson R, Radich J, Simonsson B, Silver RT, Goldman J, Hehlmann R; European LeukemiaNet. Chronic myeloid leukemia: an update of concepts and management recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol.2009 Dec 10;27(35):6041-51
  2. Baccarani M, Saglio G, Goldman J, Hochhaus A, Simonsson B, Appelbaum F, Apperley J, Cervantes F, Cortes J, Deininger M, Gratwohl A, Guilhot F, Horowitz M, Hughes T, Kantarjian H, Larson R, Niederwieser D, Silver R, Hehlmann R; European LeukemiaNet.Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia: recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet. Blood.2006 Sep 15;108(6):1809-20
  1. Baccarani M, Deininger MW, Rosti G, Hochhaus A, Soverini S, Apperley JF, Cervantes F, Clark RE, Cortes JE, Guilhot F, Hjorth-Hansen H, Hughes TP, Kantarjian HM, Kim DW, Larson RA, Lipton JH, Mahon FX, Martinelli G, Mayer J, Müller MC, Niederwieser D, Pane F, Radich JP, Rousselot P, Saglio G, Saußele S, Schiffer C, Silver R, Simonsson B, Steegmann JL, Goldman JM, Hehlmann RBlood.European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013.2013 Aug 8;122(6):872-84
  1. Müller MC, Cross NC, Erben P, Schenk T, Hanfstein B, Ernst T, Hehlmann R, Branford S, Saglio G, Hochhaus A. Harmonization of molecular monitoring of CML therapy in Europe. Leukemia.2009 Nov;23(11):1957-63.
  2. Cross NC, White HE, Müller MC, Saglio G, Hochhaus A. Standardizeddefinitions of molecular response in chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2012 Oct;26(10):2172-5
  3. Branford S, Cross NC, Hochhaus A, Radich J, Saglio G, Kaeda J, Goldman J, Hughes T. Rationale for the recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts in patients with chronic myeloid leukaemia. Leukemia. 2006 Nov;20(11):1925-30
  4. Labnet, Standard Operating Procedures 20-10-2011
  5. Ipsogen RT , BCR-ABL1 kit (1-2013)

Sviluppo e standardizzazione di metodi di monitoraggio dei livelli dei trascritto Bcr-Abl nella pratica clinica nella Leucemia Mieloide Cronica (LMC) e nella Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL) Philadelphia-positiva.

Background

Il cromosoma Philadelphia è il primo marcatore citogenetico associato alle neoplasie ematologiche ed è presente nel 95% delle leucemie mieloidi croniche (LMC) e nel 5% ed il 15-20% rispettivamente delle leucemie acute linfoblastiche (LAL) pediatriche e degli adulti.

Gli inibitori della tirosin-chinasi (TKI) rappresentano una nuova classe di composti che sono stati razionalmente progettati e sviluppati per avere come bersaglio le tirosin-chinasi. (1-5)

L'introduzione degli inibitori della tirosina chinasi (TKI) come terapia mirata nel trattamento di pazienti con CML ha rivoluzionato la prognosi di pazienti con il conseguimento nella maggior parte dei casi di risposta ematologica completa e citogenetica. Anche dopo il raggiungimento di questi risultati, la quota di malattia continua a diminuire progressivamente con il proseguimento del trattamento. Pertanto, i metodi molecolari più sensibili sono tenuti a rilevare e quantificare i livelli di malattia minima residua, soprattutto per periodi lunghi dopo l’inizio di TKI.

Il primo TKI disponibile in clinica, imatinib, è stato introdotto nel 1998 ed esercita il suo effetto legandosi competitivamente alla tasca di legame dell'ATP del dominio della tirosin chinasi ABL1 (TDK) impedendo così l'accesso agli ATP; imatinib come terapia di prima linea produce una risposta citogenetica completa nell’ 83% dei pazienti con LMC Ph + e questo dato correla con una sopravvivenza prolungata. Secondo le definizioni ELN, la risposta complessiva ad imatinib può essere definita come ottimale, subottimale e fallimentare. La seconda generazione di TKIs, nilotinb ed imatinib, è più potente e con efficacia dimostrata nei pazienti resistenti o intolleranti ad imatinib, e sono attivi contro la maggior parte delle mutazioni BCR-ABL, con l'eccezione di T315I, inoltre hanno un profilo di sicurezza ben stabilito. Essi inducono i tassi di risposta citogenetica e molecolare completa più veloci e più elevati. Pertanto, entrambi i farmaci hanno ottenuto approvazione da parte della US Food and Drug Administration per essere utilizzati in pazienti con LMC di nuova diagnosi in fase cronica (LMC-CP).

Dato che l'utilizzo dei soli TKIs può portare alla comparsa di resistenza, l'utilizzo di più di un TKI in combinazione o in rotazione può permettere di fare un notevole miglioramento rispetto al trattamento attuale. Inoltre, il raggiungimento di livelli non rilevabili di trascritto BCR-ABL è stato dimostrato essere un prerequisito fondamentale per valutare la sospensione dei TKIs. Per questo motivo molti protocolli sperimentali sono stati istituiti al fine di valutare gli effetti dei farmaci e la correlazione con la risposta molecolare.

In passato, la remissione è stata convenzionalmente valutata tramite la normalizzazione della conta totale dei globuli bianchi (risposta ematologica) ed il raggiungimento della risposta citogenetica completa (nessuna metafase Ph-positiva identificabile in almeno 20 cellule del midollo osseo). (2) Tuttavia, è stato stimato che ben 10 ^ 7 cellule leucemiche possono ancora essere presenti nel corpo di un paziente in remissione citogenetica completa e questo aumenta l'interesse per tecniche basate su PCR più sensibili. Il monitoraggio molecolare sta diventando sempre più importante per la scelta della strategia terapeutica.

Un indicatore chiave di risposta molecolare è la cosiddetta risposta molecolare maggiore (MMR), originariamente classificata come riduzione del trascritto BCR-ABL da almeno 3 log inferiori ad un valore basale standardizzato che rappresentana il valore mediano BCR-ABL/BCR presente alla diagnosi (studio IRIS). (3,4) Il raggiungimento di MMR è associata ad una migliore probabilità di risposta a lungo termine ed a una migliore sopravvivenza libera da progressione. (6,7)

Per la valutazione clinica della malattia minima residua, sono stati fatti molti sforzi per armonizzare a livello mondiale la quantificazione di BCR-ABL. Durante un incontro internazionale nel 2005, è stato proposto che le valutazioni di BCR-ABL devono essere espresse su scala internazionale (SI) e definite tramite due valori standard: un valore basale standardizzato pari al 100% sulla SI e un valore standardizzato di MMR portato al 0,1% sulla SI. Un livello dell’ 1-2% SI corrisponde grosso modo al limite al quale le metafasi Ph positive possono essere rilevate dalla citogenetica standard cioè, bassi livelli di malattia sono coerenti con CCyR. La risposta molecolare completa RMC è stata definita come trascritti BCR-ABL non rilevabili con una sensibilità <10 ^ 4.

Grazie a questo SI, i centri continuano ad utilizzare il loro sistema affermato di misura di BCR-ABL. Con l'uso di specifici fattori di conversione di standard di riferimento di laboratorio, i risultati locali possono essere convertiti al SI e dovrebbe tradursi in dati più facilmente comparabili tra i centri.

Dati recenti, tuttavia, hanno evidenziato le carenze di questa definizione. Non è possibile avere un'unica definizione funzionale di CMR, ma piuttosto il livello di risposta deve essere definito da un limite superiore.

Le definizioni attuali, modificate dopo il 2011, sono:

MR4 = malattia rilevabile se BCR-ABL1 ≤ 0,01% SI o malattia non rilevabile in cDNA con ≥ 10.000 ABL1 o ≥ 24.000 trascritti GUSB;

MR4.5 = malattia rilevabile se BCR-ABL1 ≤ 0,0032% SI o malattia non rilevabile in cDNA con ≥ 32.000 ABL1 o ≥ 77.000 trascritti GUSB;

MR5 = malattia rilevabile se BCR-ABL1 ≤ 0,001% SI o malattia non rilevabile in cDNA con ≥ 100.000 ABL1 o ≥ 240.000 trascritti GUSB.

Gli sviluppi sottolineano la necessità di definizioni robuste, standardizzate e pratiche di RM profonda. In particolare, è fondamentale che la misura della RM sia standardizzato in modo da coprire la variabilità sia intra- che inter-laboratorio nonché nuovi sviluppi metodologici. Recenti studi di valutazione delle prestazioni hanno indicato che i laboratori di prova dovrebbero essere in grado di raggiungere sensibilità sufficiente per consentire l'individuazione di MR 4.5. Per questo, il nostro laboratorio parteciperà al primo round della normalizzazione EUTOS MR 4.5

Labnet, grazie all'iniziativa del working party delle CML del GIMEMA, raggruppa i centri italiani che lavorano sulla Biologia molecolare delle CML. L'obiettivo è quello di migliorare la comparabilità dei risultati tra laboratori diversi e di ottimizzare la comunicazione con una rete nazionale. Ora ci sono tanti centri in Italia e Bologna è uno dei tre centri di coordinazione. Per questo motivo è stato organizzato il Round V di standardizzazione per la qualità interlaboratorio per controllare la precisione, accuratezza e sensibilità della tecnica e confermare o ricalcolare il fattore di conversione per ogni laboratorio.