Table des matières
Résumé 3
Introduction et étude bibliographique 3
Matériel et Méthode 4
Résultats, courbes et interprétation
De la 1ère journée 6
De la 2e journée 8
Conclusion 10
Données expérimentales 11
Résumé:
Alkaline phosphatase is a hydrolase enzyme widely used in molecular biology. One of the reactions catalyzed by alkaline phosphatase is the hydrolysis of para-nitrophenylphosphate (pNPP, a chromogenic substrate) into 4-nitrophenylphosphate (pNP) and inorganic phosphate (Pi). This catalyzed reaction is characterized by an activation energy (EA), the energy that must be overcome in order for the reaction to occur and a temperature coefficient (Q10), the rate of change in reaction rate after modifying the temperature by 10°C. In this study, we determine the EA and Q10 of the aforementioned catalyzed hydrolysis by using spectrometry to measure the velocity of the reaction at varying temperatures while the initial concentration of substrate was kept constant. We show that the reaction has an EA of xx and a Q10 of xx.
Introduction et Etude Bibliographique:
La déphosphorylation du pNPP en pNP est une réaction très utilisée en biologie comme par exemple lors d'un test ELISA. Le but de cette étude est de déterminer l'énergie d'activation de cette réaction sous catalyse par la phosphatase alcaline, et de quantifier l'effet de la température sur la vitesse de la réaction en déterminant son Q10. Dans une première journée, nous déterminerons les caractéristiques intrinsèques de l’enzyme, plus particulièrement sa concentration optimale, afin de pouvoir, lors une deuxième journée, manipuler l’enzyme et observer ses différentes activités à différentes températures.
Caractéristiques de l'Enzyme et du Substrat utilisés:
Enzyme / SubstratNom / Phosphatase alcaline / Para-Nitrophénylphosphate
Numéro EC / 3.1.3.1.
Origine / Bos taurus (muqueuse intestinale) commercialisée par Sigma (réf P5521)
Action / Groupement phosphate, bloque la recirculation de l’ADN vectoriel, déphosphorylation des résidus sérine, thréonine, tyrosine / Substrat chromogénique
Masse moléculaire / ≈ 138Kg/mol / 371.1g/mol
Structure / Associé sous forme dimérique
Activité spécifique / 35 U/mg à 25°C
Constante de Michaelis dans la réaction / 2,5.10-3 M
Point Isoélectrique / 5,7
Optimum pH / 9,8
Matériel et Méthode:
Au cours de ces manipulations, nous utiliserons le matériel suivant:
· Spectrophotomètre
· Bain Marie
· Thermomètre Digital
· pH-mètre électronique
· Verrerie (Erlenmeyer, Becher, Balance électronique, Fiole jaugée…)
Composants des cuves de mesure :
· Phosphatase alcaline en suspension dans le sulfate d'ammonium
Concentrations variables entre 10 µg/L et 100 µg/L.
· pNPP (Sigma réf N4645) : 8 mM
· Tampon et Stabilisants de la réaction :
Glycine 0,1 M, pH 10,5.
ZnCl2, 10-4 M
MgCl2, 10-3 M
Conditions de réaction:
· Temps de réaction : 5 min par essai.
· Température: variable entre 20°C et 50°C
Objectif de la 1ere journée:
Détermination de la Concentration Optimale de Phosphatase Alcaline:
Dans le but de déterminer l’énergie d’activation et le coefficient de température aux conditions optimales pour la phosphatase alcaline dans la réaction étudiée, la concentration optimale de cette enzyme a été déterminée. Pour ce faire, la vitesse initiale de la réaction a été déterminée à différentes concentrations de phosphatase alcaline, la concentration initiale du substrat (pNPP), la température (température ambiante [22°C]), et le pH (présence d’une solution tampon à pH10) restant constants. Les vitesses initiales ont été déterminées en mesurant l’évolution de la concentration de l’un des produits de la réaction (pNP) au cours du temps par spectrophotométrie. En effet, ce produit de réaction absorbe une longueur d’onde à 405nm. La loi de Beer-Lambert (voir équation 1) permet de déduire la concentration du substrat (pNP) à partir de la Densité Optique (D.O.) mesurée et de son coefficient d’extinction molaire. La courbe de vitesse initiale en fonction de la concentration d’enzyme qui en résulte permet de déduire la concentration optimale de phosphatase alcaline pour la réaction d’hydrolyse du pNPP (voir équation 2).
Équation 1 - La loi de Beer-Lambert.
Aλ = ε . C . lAvec:
Aλ: Absorption à la longueur d’onde λ exprimée en nm
ε: coefficient d’extinction molaire spécifique en Mol-1.cm-1
C: concentration en mol/L
l: Largeur de la cuve, en cm
Équation 2 – Réaction catalysée par l’enzyme.
Phosphatase alcaline + pNPP → Phosphatase alcaline + pNP + Pi
Objectif de la 2nde journée:
Détermination de l’Energie d’Activation et du Q10 de la réaction:
Pour déterminer l’énergie d’activation et le Q10, la vitesse initiale de la réaction a été mesurée à températures comprises entre 20°C et 50°C, les concentrations de phosphatase alcaline restant constante (concentration optimale de l’enzyme préalablement déterminée) ainsi que la concentration initiale de substrat (pNPP). La température a été rendue constante avant chaque essai en utilisant un dispositif relié à un bain-marie et mesurée avec un thermomètre numérique. Les vitesses initiales sont déterminées comme précédemment. En traçant la courbe Vi=f(T), nous pouvons lire graphiquement la température optimale pour laquelle l’enzyme a une activité maximale.
Par la suite, le graphe d’Arrhenius (ln Vmax = f [1/T]) permet d’obtenir une droite. La pente de cette droite correspond à l’énergie d’activation de l’enzyme divisée par la constante des gazs parfaits au signe près (pente= - Ea/ R).
N.B.: pour réaliser cette courbe, il est préférable de prendre des valeurs pour lesquelles [substrat]>Km ou [Substrat] < Km afin d’obtenir une droite sur le graphe d’Arrhenius.
Une fois l’énergie d’activation de l’enzyme déterminé, nous pourrons calculer le Q10, qui correspond au taux de variation d’activité de l’enzyme après modification de la température du milieu de 10°C. (Voir équation 3)
Équation 3 – Calcul du Q10 d’une enzyme.
Résultats, courbes et interprétations.
Résultats de la 1ère journée:
Détermination de la Concentration Optimale de Phosphatase Alcaline
Graphique 1.
Graphique 2.
Graphique 1.
A l’aide de cette courbe, nous pouvons déterminer les vitesses initiales de l’enzyme phosphatase alcaline en fonction des différentes concentrations introduites dans la cuve. On constate que la vitesse initiale (Vi) varie en fonction de la quantité d’enzyme présente.
Graphique 2.
Nous relevons ces différentes Vi correspondant aux pentes des droites, que nous reportons dans un nouveau graphique Vi=f ([Enzyme]). Sur la courbe obtenue, nous prenons les 2/3 de la hauteur plateau courbe – axe des abscisses, nous reportons cette hauteur sur la courbe, et regardons ou cela intercepte l’axe des abscisses (manipulation indiquée sur le graphique 2). Nous lisons que la concentration optimale de fonctionnement de l’enzyme a cette température, pH, et concentration de substrat est de 0,105 μM.
Cette valeur sera utilisée dans les manipulations ultérieures visant à regarder et quantifier l’influence de la température sur l’activité de la phosphatase alcaline.
Nous observons également la présence d’un plateau, ce qui signifie que l’enzyme semble atteindre une vitesse maximale, se situant aux alentours de 0.04mM/min
Résultats de la 2ème journée:
Détermination de l’Energie d’Activation et du Q10 de la réaction:
Graphique 3.
Graphique 4.
Graphique 3.
Nous remarquons tout d’abord que les droites obtenues sont différentes les unes des autres, ce que montre que la température à un effet sur l’enzyme étudiée. Nous pouvons également dore et déjà remarquer que les vitesses initiales augmentent puis diminuent en fonction de la température.
Graphique 4.
Sur ce graphique, il apparait qu’il existe une température pour laquelle l’enzyme possède une activité maximale, traduit par la forte vitesse initiale. Il s’agit de l’optimum de température, situé à 40°C, de la phosphatase alcaline.
Il y a une augmentation progressive de la Vitesse de catalyse du pNPP en pNP+Pi jusqu’à une température de 40°C, puis, la vitesse de réaction diminue. Cela est du au phénomène de dénaturation de l’enzyme, sensible aux variations de températures, et facilement dénaturable à des températures supérieures à 50°C. L’enzyme dénaturée ne pourra plus être active, même après un retour à une température plus basse: la dénaturation est un phénomène irréversible.
NB: une expérience parallèle a été réalisée: nous avons réalisé des mesures contrôle d’hydrolyse spontanée du substrat pNPP. Quelque soit la température, l’hydrolyse spontanée du substrat était non-significative donc négligée à travers ces manipulations (très peu de substrat est hydrolysé spontanément en absence d’enzyme, que ce soit à 25°C ou 50°C)
A partir des résultats obtenus dans les graphes 3&4, nous pouvons tracer un graphe d’Arrhenius nous permettant d’obtenir l’Energie d’Activation de l’enzyme ainsi que le Q10.
Graphe d’Arrhenius
Graphique 5.
Graphique 5
Détermination de l’énergie d’activation.
Pente = -Ea/R
soit -5571,3 °K = -Ea / R avec R=8.314 J/mol/°K (constante des gaz parfaits)
Donc Ea = 46325 J/mol ≈ 46,3KJ/mol
Cette valeur semble correcte; les enzymes recensées jusqu’à ce jour ont des énergies d’activations comprises entre 25KJ/Mol à 100KJ/Mol.
Calcul du Q10:
Nous prendrons comme températures celles deT1=303°K (30°C) et T2=T1+10°K=313°K (40°C)
Le Q 10 de cette enzyme est de 1,798.
Cette valeur semble correcte; les enzymes recensées jusqu’à ce jour ont des Q10 se situant aux alentours de 2.
Conclusion:
La phosphatase alcaline issue de la muqueuse intestinale de bovin a une activité maximale pour une température de 40°C. Les différents graphes et calculs nous ont permis de déterminer l’énergie d’activation Ea qui est de 46.3KJ/Mol et le Q10 qui est de 1.798.
L’activité étant maximale a une température de 40°C, on pourrait se demander si la température corporelle des bovins correspond à 40°C, contrairement à l’homme avec ses 37°C environ. Est-ce que la phosphatase alcaline humaine est similaire à celle de Bos taurus? ou bien présente t’elle des variations des acides aminés composants l’enzyme, lui permettant d’avoir un optimum de température de 37°C chez l’homme? Il serait en effet intéressant de comparer les structures et les propriétés des différentes phosphatases alcalines des mammifères.
Nous pourrions également nous interroger sur la nature de l’inactivation de l’enzyme: qu’est-ce qui fait que l’enzyme perd de son efficacité avec des températures élevées?
Données expérimentalesGraphique 1& 2:
[Enz] Temps / 2,5 μM / 3 μM / 3,5 μM / 5 μM / 7,5 μM / 10 μM / 12,5 μM / 15 μM0,5 min / 0,051 / 0,102 / 0,135 / 0,153 / 0,169 / 0,156 / 0,176 / 0,185
1 min / 0,126 / 0,175 / 0,271 / 0,353 / 0,451 / 0,459 / 0,536 / 0,512
1,5 min / 0,212 / 0,29 / 0,457 / 0,537 / 0,767 / 0,806 / 0,896 / 0,927
2 min / 0,261 / 0,41 / 0,645 / 0,782 / 1,121 / 1,178 / 1,256 / 1,296
2,5 min / 0,314 / 0,478 / 0,779 / 0,921 / 1,365 / 1,456 / 1,616 / 1,669
3 min / 0,406 / 0,595 / 0,812 / 1,125 / 1,649 / 1,749 / 1,976 / 2,105
3,5 min / 0,495 / 0,666 / 1,101 / 1,321 / 1,963 / 2,106 / 2,336 / 2,411
4 min / 0,569 / 0,695 / 1,281 / 1,652 / 2,285 / 2,485 / 2,696 / 2,751
4,5 min / 0,612 / 0,842 / 1,423 / 1,723 / 2,561 / 2,756
5 min / 0,682 / 0,948 / 1,563 / 2,125
[Enz] en μM / 0,05 / 0,06 / 0,07 / 0,1 / 0,15 / 0,2 / 0,25 / 0,3
Vi (en mM/min) / 0,0076 / 0,01 / 0,0173 / 0,0228 / 0,0324 / 0,0354 / 0,0389 / 0,0404
Graphique 3 & 4:
T° (°C) / [Enz] en μM 0,5 / [Enz] en μM 1 / [Enz] en μM 1,5 / [Enz] en μM 2 / [Enz] en μM 2,5 / [Enz] en μM 3 / [Enz] en μM 3,521 / 0,013189189 / 0,02383784 / 0,03475676 / 0,04572973 / 0,05637838 / 0,06675676 / 0,07805405
25,2 / 0,010540541 / 0,02227027 / 0,03535135 / 0,04594595 / 0,05772973 / 0,06935135 / 0,08108108
30 / 0,013783784 / 0,02864865 / 0,04167568 / 0,05735135 / 0,07010811 / 0,084 / 0,09935135
35 / 0,017135135 / 0,03302703 / 0,05145946 / 0,06491892 / 0,08172973 / 0,09794595 / 0,11481081
40 / 0,027027027 / 0,04610811 / 0,06864865 / 0,08081081 / 0,10172973 / 0,12259459 / 0,14162162
45,3 / 0,023027027 / 0,04237838 / 0,06037838 / 0,08010811 / 0,10048649 / 0,11805405 / 0,13048649
50,1 / 0,019297297 / 0,02756757 / 0,04675676 / 0,07362162 / 0,09205405 / 0,10037838 / 0,102
T° (°C) / [Enz] en μM 4 / [Enz] en μM 4,5 / [Enz] en μM 5
21 / 0,0892973 / 0,10054054 / 0,11162162
25,2 / 0,09259459 / 0,10378378 / 0,11443243
30 / 0,11372973 / 0,12751351 / 0,13994595
35 / 0,12886486 / 0,13740541 / 0,14897297
40 / 0,15416216
45,3 / 0,14227027 / 0,14583784 / 0,15513514
50,1 / 0,10151351 / 0,12145946
Température (en °C) / Vi (en mM/min)
21 / 0,006
25,2 / 0,007
30 / 0,008
35 / 0,0093
40 / 0,011
45,3 / 0,009
50,1 / 0,008
Données Graphe d’Arrhenius:
T en °C / T en °K / 1/T / Kcat (mM/min) / ln Kcat21 / 294 / 0,00340136 / 0,0076 / -4,87960703
25,2 / 298,2 / 0,00335345 / 0,01 / -4,60517019
30 / 303 / 0,00330033 / 0,0173 / -4,05704878
35 / 308 / 0,00324675 / 0,0228 / -3,78099474
40 / 313 / 0,00319489 / 0,0324 / -3,42959686
45,3 / 318,3 / 0,00314169 / 0,0354 / -3,34104346
50,1 / 323,1 / 0,00309502 / 0,0389 / -3,24676103